Ключовата разлика между хеликаза и топоизомераза е, че хеликаза е ензим, който разделя две взаимно допълващи се вериги на ДНК чрез разкъсване на водородни връзки между основите на две вериги, докато топоизомеразата е ензим, който премахва положителните и отрицателните суперспирали, образувани по време на процеса на размотаване на ДНК чрез рязане и запечатване на една или и двете вериги на ДНК дуплекса.
ДНК е двойна спирала. Съществува в две допълнителни нишки, свързани заедно чрез водородни връзки. ДНК репликацията, транскрипцията и възстановяването на ДНК изискват две нишки да бъдат отделени една от друга, за да се направят нови копия, да се направи иРНК и да се добавят нуклеотиди за възстановяване. Двата ензима хеликаза и топоизомераза влизат в игра в този момент. Следователно както хеликаза, така и топоизомерази са от съществено значение за размотаването на ДНК. Хеликаза отделя двуверижната ДНК на единични вериги чрез разкъсване на водородните връзки между двойките нуклеотидни основи в двуверижна ДНК. За разлика от това, топоизомеразата разнищва обрата на ДНК и облекчава природата на ДНК суперспиралата, като реже гръбнака на ДНК фосфата или в едната, или и в двете вериги.
