Ключова разлика - NGS срещу Sanger Sequencing
Последователността от следващо поколение (NGS) и Последователността на Sanger са два вида техники за секвениране на нуклеотиди, разработени с течение на времето. Методът на Sanger Sequencing беше широко използван в продължение на много години и NGS го замени наскоро поради своите предимства. Ключовата разлика между NGS и Sanger Sequencing е, че NGS работи на принципа на секвениране на милиони последователности едновременно по бърз начин чрез система за секвениране, докато Sanger Sequencing работи върху принципа на прекратяването на веригата поради селективно включване на дидеоксинуклеотиди от ензима на ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК и полученото разделяне на фрагменти чрез капилярна електрофореза.
СЪДЪРЖАНИЕ
1. Общ преглед и ключова разлика
2. Какво е нуклеотидно секвениране
3. Какво е NGS
4. Какво е секвенциране на Sanger
5. Сравнение едно до друго - NGS срещу Sanger секвениране
6. Обобщение
Какво е нуклеотидно секвениране?
Генетичната информация се съхранява в нуклеотидните последователности на ДНК или РНК на организма. Процесът на определяне на правилния ред на нуклеотидите (с помощта на четири основи) в даден фрагмент (в ген, клъстер от гени, хромозома и пълен геном) е известен като нуклеотидно секвениране. Много е важно в геномните изследвания, криминалистичните изследвания, вирусологията, биологичната систематика, медицинската диагностика, биотехнологиите и в много други области да се анализира структурата и функцията на гените. Съществуват различни видове методи за секвениране, разработени от учени. Сред тях, последователността на Sanger, разработена от Фредерик Sanger през 1977 г., беше широко използвана и популяризирана за дълъг период от време, докато последователността от следващото поколение я замени.
Какво е NGS?
Последователност от следващо поколение (NGS) е термин, използван за означаване на съвременни процеси на последователност с висока производителност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране, които революционизират геномните изследвания и молекулярната биология. Тези техники са секвениране на Illumina, секвенциониране на Roche 454, секвениране на йонни протони и секвениране на SOLiD (секвениране чрез откриване на лигиране на Oligo). Системите NGS са по-бързи и по-евтини. Четири основни метода за секвениране на ДНК се използват в системите NGS, а именно; пиросеквениране, секвениране чрез синтез, секвениране чрез лигиране и йонно полупроводниково секвениране. Голям брой ДНК или РНК вериги (милиони) могат да бъдат секвенирани паралелно. Той позволява секвениране на целия геном на организмите в рамките на кратък период от време, за разлика от секвенирането на Сангер, което отнема повече време.
NGS има много предимства пред конвенционалния метод на Sanger за секвениране. Това е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес, който може да се извърши с малък размер на пробата. NGS може да се използва в метагеномни изследвания, при откриване на вариации в рамките на отделен геном поради вмъквания и делеции и т.н. и при анализ на генни експресии.
Фигура_1: Развитие в NGS последователността
Какво е секвениране на Sanger?
Sanger Sequencing е метод за секвениране, разработен от Фредерик Sanger и неговите колеги през 1977 г., за да се определи точния нуклеотиден ред на даден фрагмент от ДНК. Известно е също като последователност за прекратяване на вериги или дидеокси секвениране. Принципът на работа на този метод е прекратяването на синтеза на веригата чрез селективно включване на верига, прекратяваща дидеоксинуклеотиди (ddNTPs) като ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP чрез ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК. Нормалните нуклеотиди имат 3 'OH групи за образуване на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди, за да продължи образуването на веригата. Обаче, ddNTPs нямат тази 3 'OH група и не са в състояние да образуват фосфодиестерни връзки между нуклеотидите. Следователно удължаването на веригата е спряно.
При този метод едноверижната ДНК, която трябва да бъде секвенирана, служи като матрична верига за in vitro синтез на ДНК. Други изисквания са олигонуклеотиден праймер, дезоксинуклеотидни прекурсори и ДНК полимеразен ензим. Когато фланкиращите краища на целевия фрагмент са известни, праймерите могат лесно да бъдат проектирани за репликация на ДНК. Четири отделни реакции на ДНК синтез се извършват в четири отделни епруветки. Всяка тръба има отделни ddNTP, заедно с други изисквания. От конкретния нуклеотид се добавя смес от dNTPs и ddNTPs. По същия начин се провеждат четири отделни реакции в четири епруветки с четири смеси. След реакциите се извършва откриване на ДНК фрагменти и преобразуване на фрагментния модел в информация за последователността. Получените ДНК фрагменти се денатурират и отделят чрез гел електрофореза. Ако се използват радиоактивни нуклеотиди, схемата на свързване в полиакриламидния гел може да бъде визуализирана чрез авторадиография. Когато този метод използва флуоресцентно маркирани дидеоксинуклеотиди, той може да бъде смекчен надолу по гела за отчитане и преминат през лъч лазер, за да бъде открит от флуоресцентния детектор. За да се избегнат грешки, които могат да възникнат, когато една последователност се чете от окото и се въвежда ръчно в компютър, този метод се превърна в използването на автоматизиран секвенсор, свързан с компютъра. За да се избегнат грешки, които могат да възникнат, когато една последователност се прочете от окото и се въведе ръчно в компютър, този метод се превърна в използването на автоматизиран секвенсор, свързан с компютъра. За да се избегнат грешки, които могат да възникнат, когато една последователност се чете от окото и се въвежда ръчно в компютър, този метод се превърна в използването на автоматизиран секвенсор, свързан с компютъра.
Това е методът, използван за секвениране на ДНК от проекта за човешкия геном. Този метод все още се използва с разширени модификации, тъй като дава точна информация за последователността, въпреки че е скъп и бавен процес.
Фигура_2: Последователност на Sanger
Каква е разликата между NGS и Sanger Sequencing?
Различна статия Средна преди таблица
NGS срещу Sanger Последователност |
|
| Последователността от следващо поколение (NGS) се отнася до съвременните процеси на последователност с висока производителност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране | Sanger Sequencing е метод за секвениране, разработен от Frederick Sanger за определяне на точния нуклеотиден ред на даден фрагмент от ДНК. |
| Ефективност на разходите | |
| NGS е по-евтин процес, тъй като намалява времето, човешката мощ и химикалите. | Това е скъп процес, защото отнема време, човешка мощ и повече химикали. |
| Скорост | |
| Това е по-бързо, тъй като както химическото откриване, така и сигналното откриване на много нишки се случват паралелно. | Това отнема много време, тъй като откриването на химикали и откриването на сигнали се случва като два отделни процеса и може да се чете наведнъж само на нишка. |
| Надеждност | |
| NGS е надежден. | Последователността на Sanger е по-малко надеждна |
| Размер на пробата | |
| NGS изисква по-малко количество ДНК. | Този метод се нуждае от голямо количество шаблонна ДНК. |
| ДНК бази на секвениран фрагмент | |
| Броят на ДНК основите на секвениран фрагмент е по-малък от метода на Sanger | Генериращите последователности са по-дълги от NGS последователностите. |
Резюме - NGS срещу Sanger Sequencing
NGS и Sanger Sequencing са нуклеотидни техники за секвениране, широко използвани в молекулярната биология. Sanger секвенирането е ранен метод на секвениране, който е заменен от NGS. Основната разлика между NGS и Sanger Sequencing е, че NGS е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес от Sanger секвенирането. И двете техники създадоха големи огнища в генетиката и биотехнологиите.
