Ключова разлика - Последователност на Sanger срещу пиросеквенция
ДНК секвенирането е много важно за ДНК анализа, тъй като познаването на правилното подреждане на нуклеотидите в определен ДНК регион разкрива много важна информация за него. Съществуват различни методи за секвениране на ДНК. Sanger секвениране и пиросеквениране са два различни метода за секвениране на ДНК, широко използвани в молекулярната биология. Ключовата разлика между секвенцията на Сангер и пиросеквенцията е, че секвенцията на Сангер използва дидеоксинуклеотиди, за да прекрати синтеза на ДНК, за да отчете нуклеотидната последователност, докато пиросеквенирането открива освобождаването на пирофосфат, като включва нуклеотидите и синтезира комплементарната последователност, за да прочете точния ред на последователността.
СЪДЪРЖАНИЕ
1. Общ преглед и ключова разлика
2. Какво е секвениране на Сангер
3. Какво е пиросеквенция
4. Успоредно сравнение - Секвениране на Сангер срещу пиросеквениране
5. Резюме
Какво е секвениране на Sanger?
Последователността на Sanger е първо поколение ДНК метод за секвениране, разработен от Frederick Sanger и неговите колежи през 1977 г. Той е известен също като Chain Termination Sekvencing или Dideoxy последователност, тъй като се основава на прекратяване на веригата от дидеоксинуклеотиди (ddNTPs). Този метод се използва широко в продължение на повече от 30 години, докато не бъде разработена секвенцията от ново поколение (NGS). Техниката на секвениране на Sanger позволява откриването на правилния нуклеотиден ред или прикрепването на определен ДНК фрагмент. Той се основава на селективно включване на ddNTPs и прекратяване на синтеза на ДНК по време на ин витро репликацията на ДНК. Липсата на 3 'OH групи за продължаване на образуването на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди е уникална характеристика на ddNTPs. Следователно, след като ddNTP е прикрепен, удължаването на веригата спира и завършва от тази точка. Има четири ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP - използвани в секвенирането на Sanger. Тези нуклеотиди спират процеса на репликация на ДНК, когато са включени в нарастващата верига на ДНК и водят до различна дължина на късата ДНК. Капилярна гел електрофореза се използва за организиране на тези къси ДНК вериги по техните размери върху гел, както е показано на Фигура 01.
Фигура 1: Капилярна гел електрофореза на синтезирана къса ДНК
За in vitro репликация на ДНК трябва да се предоставят малко изисквания. Те са ДНК полимеразен ензим, матрична ДНК, олигонуклеотидни праймери и дезоксинуклеотиди (dNTPs). При секвенирането на Sanger репликацията на ДНК се извършва в четири отделни епруветки заедно с четири вида ddNTPs поотделно. Деоксинуклеотидите не са напълно заместени от съответните ddNTP. Смес от конкретния dNTP (например; dATP + ddATP) се включва в епруветката и се репликира. Четири отделни епруветки се пускат върху гел в четири отделни ямки. След това чрез четене на гела последователността може да бъде конструирана, както е показано на Фигура 02.
Фигура 02: Последователност на Sanger
Последователността на Sanger е важна техника, която помага в много области на молекулярната биология. Проектът за човешкия геном беше успешно завършен с помощта на методите, базирани на последователността на Sanger. Последователността на Sanger е полезна и при целево ДНК секвениране, изследване на рак и генетични заболявания, анализ на генна експресия, идентифициране на хора, откриване на патогени, микробно секвениране и др.
Има няколко недостатъка на последователността на Sanger:
- Дължината на секвенираната ДНК не може да бъде по-голяма от 1000 базови двойки
- Само една нишка може да бъде секвенирана наведнъж.
- Процесът отнема много време и е скъп.
Следователно с времето бяха разработени нови усъвършенствани техники за секвениране, за да се преодолеят тези проблеми. Въпреки това, последователността на Sanger все още се използва поради своите изключително точни резултати до приблизително 850 фрагмента с дължина на основната двойка.
Какво е пиросеквенция?
Пиросеквенирането е нова техника за секвениране на ДНК, базирана на „секвенирането чрез синтез“. Тази техника разчита на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотида. Процесът се използва от четири различни ензима: ДНК полимерза, АТФ сулфурилаза, луцифераза и апираза и два субстрата аденозин 5 'фосфосулфат (APS) и луциферин.
Процесът започва с праймерното свързване с едноверижния ДНК шаблон и ДНК полимеразата започва включването на нуклеотиди, допълващи го. Когато нуклеотидите се обединят (полимеризация на нуклеинова киселина), той освобождава пирофосфатни (две фосфатни групи, свързани заедно) групи и енергия. Всяко добавяне на нуклеотид освобождава еквимоларно количество пирофосфат. Пирофосфатът се превръща в АТФ чрез АТФ сулфурилаза в присъствието на субстрат APS. Генерираният АТФ задвижва медиираното от луцифераза преобразуване на луциферин в оксилуциферин, произвеждайки видима светлина в количества, пропорционални на количеството АТФ. Светлината се открива от устройство за откриване на фотони или от фотоумножител и създава пирограма. Апиразата разгражда ATP и невключените dNTPs в реакционната смес. dNTP добавянето се извършва веднъж наведнъж. Тъй като добавянето на нуклеотид е известно според включването и откриването на светлина, може да се определи последователността на матрицата. Пирограмата се използва за генериране на нуклеотидна последователност на пробата ДНК, както е показано на фигура 03.
Пиросеквенирането е много важно при анализ на единичен нуклеотиден полиморфизъм и секвениране на къси участъци на ДНК. Високата точност, гъвкавост, лекота на автоматизация и паралелна обработка са предимствата на пиросеквенирането пред техниките на Sanger за секвениране.
Фигура 03: Пиросеквенция
Каква е разликата между последователността на Sanger и пиросеквенцията?
Различна статия Средна преди таблица
Последователност на Sanger срещу пиросеквенция |
|
| Sanger секвенирането е метод за секвениране на ДНК, основан на селективно включване на ddNTPs чрез ДНК полимераза и прекратяване на веригата. | Пиросеквенирането е метод за секвениране на ДНК, основан на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотид. |
| Използване на ddNTP | |
| ddNTP се използват за прекратяване на репликацията на ДНК | ddNTP не се използват. |
| Включени ензими | |
| Използват се ДНК полимерази. | Използват се четири ензима: ДНК полимераза, АТФ сулфурилаза, луцифераза и апираза. |
| Използвани основи | |
| APS и Luciferin не се използват. | Използват се аденозин 5 'фосфосулфат (APS) и луциферин. |
| Максимална температура | |
| Това е бавен процес. | Това е бърз процес. |
Резюме - Последователност на Sanger срещу пиросеквениране
Последователността на Сангер и Пиросеквенирането са два метода за ДНК секвениране, използвани в молекулярната биология. Последователността на Sanger конструира последователността на нуклеотидите последователно чрез прекратяване на удължаването на веригата, докато пиросеквенирането изгражда точния ред на нуклеотидите последователно чрез включване на нуклеотиди и откриване на освобождаването на пирофосфати. Следователно, основната разлика между секвенирането на Sanger и пиросеквенирането е, че секвенцията на Sanger работи върху секвенирането чрез прекратяване на веригата, докато пиросеквенирането работи върху секвенирането чрез синтез.
