Ключова разлика - Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing
Нуклеотидите са основните структурни единици и градивни елементи на ДНК. ДНК молекулата е съставена от полинуклеотидна верига. В ДНК има четири различни нуклеотида. Тези нуклеотиди са съставени от четири различни азотни основи, наречени A (аденин), G (гуанин), C (цитозин), T (тимин). Редът на нуклеотидите в ДНК молекулата има голямо значение, тъй като кодира важна генетична информация за растежа и развитието на организмите. ДНК секвенирането се отнася до процеса, който определя точната нуклеотидна последователност на ДНК. Съществуват различни методи за секвениране на ДНК. Maxam Gilbert секвениране и Sanger ДНК секвениране са два метода на ДНК секвениране, които принадлежат към първо поколение секвениране. Процедурата на секвениране на Maxam Gilbert определя основната последователност чрез химическо разцепване на 5 'маркираните с край ДНК фрагменти, за предпочитане при всеки от четирите нуклеотида и гел електрофореза. Процедурата на Sanger за секвениране определя нуклеотидната последователност чрез синтезиране на едноверижна ДНК с помощта на ДНК полимераза и дидеоксинуклеотиди и гел електрофореза. Това е ключовата разлика между секвенирането на Maxam Gilbert и Sanger.
СЪДЪРЖАНИЕ
1. Общ преглед и ключова разлика
2. Какво е Maxam Gilbert
3. Какво е Sanger Sequencing
4. Успоредно сравнение - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
5. Резюме
Какво представлява секвенирането на Maxam Gilbert?
Maxam Gilbert секвениране, известен също като метод на химическо секвениране, е техника, която е разработена за определяне на реда на нуклеотидите в ДНК. Този метод е въведен от Уолтър Гилбърт и Алън Максим през 1976 г. и става популярен, тъй като може да се извършва директно с пречистена ДНК. Методът на Maxam Gilbert принадлежи към първото поколение ДНК секвениране и това е първият метод за секвениране, използван широко от учените.
Основният принцип на този метод се състои в ограничаването на крайните маркирани фрагменти на ДНК при специфични основи чрез специфични за базата химикали и условия и разделяне на маркираните фрагменти чрез електрофореза, както е показано на фигура 01. гел. Тъй като фрагментите са маркирани, последователността на ДНК молекулата може лесно да бъде изведена.
Методът на Maxam gilbert използва специфични за основата химикали за разбиване на ДНК на специфични основи. Две често срещани химикали, наречени диметил сулфат и хидразин, се използват за селективно атакуване на пурини и пиримидини, съответно.
Методът на секвениране на Maxam Gilbert се извършва чрез няколко стъпки, както следва.
- Пречистване на ДНК последователността с помощта на рестрикционни ендонуклеази
- Маркиране на краищата на ДНК фрагментите чрез добавяне на радиоактивни фосфати
- Пречистване на маркираните фрагменти от немаркирани фрагменти чрез гел електрофореза
- Разделяне на крайно маркираната ДНК в четири епруветки и третиране с основни специфични химикали поотделно
- Електрофореза на съдържанието на всяка епруветка на отделни линии върху гел и разделяне на фрагменти според тяхната дължина.
- Откриване на фрагментите чрез авторадиограф.
Фигура 01: Последователност на Maxam Gilbert
Какво е секвениране на Sanger?
Sanger Sequencing е метод за секвениране, разработен от Фредерик Sanger и неговите колеги през 1977 г., за да се определи основната последователност на даден ДНК фрагмент. Известен е също като секвенция за прекратяване на вериги или метод на дидеокси секвениране. Този метод работи на принципа на селективно включване на верижно завършващи дидеоксинуклеотиди (ddNTPs) като ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP чрез ДНК полимераза по време на синтеза на едноверижна ДНК за прекратяване на образуването на веригата. На дидеоксинуклеотидите липсват 3 'ОН групи за образуване на фосфодиестерни връзки със съседен нуклеотид. Следователно, образуването на веригата спира, след като ddNTP се включи в новообразуващата се верига по време на последователността на sanger.
При този метод се извършват четири отделни реакции на синтез на ДНК (PCR) в четири отделни епруветки с един тип ddNTP. За епруветките за PCR се предоставят и други изисквания, включително праймери, dNTPs, Taq полимераза, специфични условия и т.н. Четири отделни реакции се провеждат в четири епруветки с четири смеси. След PCR реакции получените ДНК фрагменти се денатурират и се разделят чрез гел електрофореза. След това фрагментите се визуализират, като се използва или етикетиран (радиоактивен или флуоресцентен) грунд или dNTPs, както е показано на фигура 02.
Фигура 02: Последователност на Sanger
Каква е разликата между секвенирането на Maxam Gilbert и Sanger?
Различна статия Средна преди таблица
Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert секвениране е първата техника, разработена за секвениране на ДНК. | Методът на секвениране на Sanger е въведен след метода на секвениране Maxam Gilbert. |
| Употреба | |
| Този метод се използва рядко. | Последователността на Sanger се използва рутинно за секвениране. |
| Използване на опасни химикали | |
| Използва опасни химикали. | Използването на опасни химикали е ограничено в сравнение с метода на Maxam Gilbert. |
| Етикетиране за откриване | |
| Този метод използва радиоактивен P 32 за маркиране на краищата на ДНК фрагментите. | Последователността на Sanger използва радиоактивно или флуоресцентно маркирани ddNTPs. |
Резюме - Maxam Gilbert срещу Sanger Sequencing
Maxam Gilbert и Sanger секвениране са два вида техники за секвениране на ДНК, попадащи в първо поколение ДНК секвениране. Maxam Gilbert секвенирането е първият метод, въведен за секвениране на ДНК през 1976 г. и се извършва чрез разбиване на крайните маркирани ДНК фрагменти от специфични за база химикали. Следователно, то е известно като химично секвениране. Методът за последователност на Sanger е въведен през 1977 г. и се основава на реакциите на прекратяване на веригата, управлявани от ddNTP. Метод на секвениране на Sanger, популярен от метода на Maxam Gilbert поради няколко недостатъка на метода на Maxam Gilbert, като прекомерна консумация на време, използване на опасни химикали и др. Това е разликата между секвенирането на Maxam Gilbert и Sanger.
