Ключова разлика - Северно срещу Южно срещу Западно петно
Откриването на специфични последователности на ДНК, РНК и протеини е от съществено значение за различни видове изследвания в молекулярната биология. Гелната електрофореза е техника, която разделя ДНК, РНК и протеини според техните размери. От гелните профили, специфична ДНК последователност, РНК последователност или протеин се откриват чрез специалните техники, наречени блотиране и хибридизация с маркирани сонди. Има три различни вида попивателни методи, а именно южен, северен и западен. Ключовата разлика между северното южно и западното попиване се крие в типа на молекулата, която тя открива от проба. Саутерн блотинг е метод, който открива специфична ДНК последователност от ДНК проба. Северното блотиране е техника, която открива специфична РНК последователност от РНК проба. Western blot е метод, който открива специфичен протеин от протеинова проба.
СЪДЪРЖАНИЕ
1. Общ преглед и ключова разлика
2. Какво е южно петно
3. Какво е северно петно
4. Какво е западно петно
5. Сравнение рамо до рамо - Северно срещу Южно срещу Западно петно
6. Резюме
Какво представлява Южното петно?
Техниката на Southern blot е разработена от EM Southern през 1975 г. за идентифициране на специфична ДНК последователност от ДНК проба. Това е първата попиваща техника, въведена в молекулярната биология. Той даде възможност за откриване на специфични гени от ДНК, специфични фрагменти от ДНК и т.н. Има няколко стъпки, участващи в техниката на ютър-блотинг. Те са както следва.
- ДНК се изолира от пробата и се усвоява с рестрикционни ендонуклеази.
- Разградената проба се отделя чрез електрофореза в агарозен гел.
- ДНК фрагментите в гела се денатурират в единични вериги чрез използване на алкален разтвор.
- Едноверижната ДНК се прехвърля към нитроцелулозна филтърна мембрана чрез капилярен трансфер.
- Прехвърлената ДНК се фиксира за постоянно върху мембраната.
- Фиксираната ДНК на мембраната се хибридизира с маркирани сонди.
- Несвързаната ДНК се отмива от мембраната чрез измиване.
- Рентгеновият филм се излага на мембраната и се приготвя авторадиограф.
Саутерн блотинг се прилага за различни аспекти на молекулярната биология. Полезен е при RFLP картографиране, криминалистични изследвания, метилиране на ДНК в генната експресия, откриване на мутирали гени при генетични нарушения, отпечатване на ДНК и т.н.
Фигура 01: Техника на южно петно
Какво е Северно петно?
Northern blot е метод, предназначен за откриване на специфична РНК последователност или иРНК последователност от проба за изследване на генната експресия. Тази техника е разработена от Alwine, Kemp и Stark през 1979 г. Тя се различава от техниките за северно и западно попиване поради няколко стъпки. Тази техника обаче се извършва и чрез гел електрофореза, попиване и хибридизация със специфично маркирани сонди и откриване. Техниката на северно попиване се извършва, както следва.
- РНК се извлича от пробата и се отделя чрез гел електрофореза.
- РНК се прехвърля от гела върху попиваща мембрана и се фиксира.
- Мембраната се третира с маркирана сонда, приготвена от кДНК или РНК (сондата допълва определена последователност в пробата).
- Сондата се инкубира с мембраната, за да се свърже със специфична последователност.
- Несвързаните сонди се измиват.
- Хибридизирани фрагменти се откриват с авторадиограф.
Северното блотиране е важен инструмент за откриване и количествено определяне на хибридизираната иРНК, изучаване на деградацията на РНК, оценка на полуживота на РНК, откриване на снаждане на РНК, изследване на генната експресия и др.
Фигура 02: Северно петно
Какво е Western Blotting?
Уестърн блотингът е метод за откриване на специфичен протеин от протеинова смес чрез използването на маркирано антитяло. Следователно, Western blot е известен още като имуноблот. Тази техника е въведена от Towbin et al през 1979 г. и сега тя се извършва рутинно в лабораториите за анализ на протеини. Стъпките са както следва.
- Протеините се извличат от пробата
- Протеините се разделят по техните размери, като се използва електрофореза в полиакриламиден гел
- Отделените молекули се прехвърлят в PVDF мембрана или нитроцелулозна мембрана чрез електропорация
- Мембраната е блокирана за неспецифично свързване с антителата
- Прехвърлените протеини се свързват с първично антитяло (белязани с ензими антитела).
- Мембраната се измива, за да се отстранят неспецифично свързани първични антитела
- Свързаните антитела се откриват чрез добавяне на субстрат и откриване на образуваната цветна утайка
Уестърн блотингът е полезен при откриването на антитела срещу ХИВ в проба от човешки серум. Western blot може също да се използва като потвърдителен тест за инфекция с хепатит В и окончателен тест за болест на луда крава.
Фигура 03: Western Blotting
Каква е разликата между Северното Южно и Западното петно?
Различна статия Средна преди таблица
Северно срещу Южно срещу Западно петно |
|
| Тип на откритата молекула | |
| Северно петно | Северното попиване открива специфична РНК последователност от РНК проба. |
| Южно петно | Саутерн блотинг открива специфична ДНК последователност от ДНК проба. |
| Западно петно | Western blotting открива специфичен протеин от протеинова проба. |
| Тип гел | |
| Северно петно | Това използва агароза / формалдехиден гел. |
| Южно петно | Това използва Agarose гел. |
| Западно петно | Това използва полиакриламиден гел. |
| Метод за пеене | |
| Северно петно | Това е капилярен трансфер. |
| Южно петно | Това е капилярен трансфер. |
| Западно петно | Това е електрически трансфер. |
| Използвани сонди | |
| Северно петно | кДНК или РНК сонди, маркирани радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Южно петно | ДНК сондите са етикетирани радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Западно петно | Първичните антитела се използват като сонди. |
| Система за откриване | |
| Северно петно | Това се прави с помощта на авторадиограф или откриване на промяна на светлината или цвета. |
| Южно петно | Това се прави с помощта на авторадиограф, откриване на промяна на светлината или цвета. |
| Западно петно | Това се прави с помощта на откриване на промяна на светлината или цвета. |
Обобщение - Северно срещу Южно срещу Западно петно
Блотингът е специална техника, разработена за идентифициране на специфична ДНК, РНК или протеин от пробите. Има три отделни попивателни процедури, а именно северна, южна и западна, за откриване на специфичен тип молекула. Техниката на Northern blot е предназначена за откриване на специфична РНК последователност от смес от РНК. Техниката на Southern blot позволява откриването на специфична ДНК последователност от ДНК проба, а техниката Western blotting е разработена за идентифициране на специфичен протеин от протеинова смес.
